超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,  SOD）试剂盒说明书（WST-8法）

                                                分光光度法50管/48样 天津本生

正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                            

测定意义：

SOD（EC  1.15.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成H2O2和O2。SOD不仅是超氧化物阴离子清除酶，也是H2O2主要生成酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用。

测定原理：

通过huangpl及huangpl氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2-.)，O2-.可与WST-8反应产生水溶性染料甲臜，后者在450nm处有吸收；SOD可清除O2-.，从而抑制了甲臜的形成；反应液黄色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。

组成：

自备仪器和用品：

分光光度计、离心机、移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g  4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g  4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。

2、 试剂三的稀释：将试剂三用蒸馏水稀释50倍，用多少配多少。（试剂三和蒸馏水1：49稀释。

3、  工作液配制：在试剂一加入250μl试剂二，充分混匀。配好的试剂4℃避光可保存一周。（若一次性测定样本较少，可按照实际用量将试剂一和试剂二按照20ml：0.1ml的比例混匀配制）

4、 将一瓶试剂四用5ml蒸馏水溶解（溶解后一周内用完）。

5、 样本测定（在1ml玻璃比色皿中依次加入下列试剂）

充分混匀，室温静置30min后，450nm处测定各管吸光值A。

注意事项:

1、试剂三为酶，不可冷冻，使用时在冰上放置。

2、对照管只需要做一管。

3、SOD为什么有的样本测定管大于对照管，对照管数值在什么范围？

对照管的范围是0.8-2。对照管吸光值过低可能是（1）试剂三活性低，可以适当减少稀释倍数；（2)没有按顺序加试剂；（3）反应时间不够，可以延长反应时间（反应时间30min可以延长到40min）。对照管吸光值过高可能是试剂三未按操作说明书稀释相应倍数。

若出现测定管大于对照管，可能是样本中杂质的影响太大，为了降低杂质的影响一般将样本提取上清液用蒸馏水或提取液稀释10倍后再测，通常可以使测定正常。计算公式中乘以相应稀释倍数。

SOD活性计算：

1、抑制百分率的计算

抑制百分率＝(A对照管－A测定管) ÷A对照管× 100%

尽量使样本的抑制百分率在10-90%范围内。如果计算出来的抑制百分率小于10%或大于90%，则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需将样本用提取液适当稀释；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度比较高的待测样本。

2、SOD酶活性单位：在上述huangpl氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位(U/ml)。

3、SOD酶活性计算：

（1）血清（浆）SOD活性(U/ml)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V反总]÷V样=20×抑制百分率÷(1－抑制百分率)

（2）组织、细菌或培养细胞SOD活力计算：

a.按样本蛋白浓度计算

SOD活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V反总]÷(V样×Cpr) =20×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷Cpr

需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。

b.按样本鲜重计算

SOD活性(U/g 鲜重)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)×V反总]÷(W ×V样÷V样总)=20×抑制百分率÷(1－抑制百分率)÷W

c.按细菌或细胞个数计算

SOD活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1－抑制百分率)  ×V反总]÷(500×V样÷V样总) =0.04×抑制百分率÷(1－抑制百分率)

V反总：反应体系总体积，1ml；V样：加入反应体系中样本体积，0.05ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml  ；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。