本生资讯：考马斯蓝染料原理、使用步骤汇总

　　考马斯蓝染料简介：

　　考马斯蓝广泛用于琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的可视化。

　　考马斯亮蓝R250(红色染成蓝色)电泳(更灵敏：可以检测到0.1微克蛋白质)，考马斯蓝G250(浅绿色蓝色)用于溶液中的蛋白质分析(方便-可溶)。两者都可以用于每种应用中，但是它们可以互换使用，因为它们可以将蛋白质染色成不同的强度和颜色。

　　考马斯蓝染料技术说明：

　　考马斯蓝R-250和G-250染料是考马斯染料的两种最常见的化学形式，是二磺化的三苯基甲/烷化合物。R-250(红色)缺少以G-250(绿色)形式存在的两个甲基。“250"最初表示染料的纯度。

　　考马斯蓝染色原理：

　　不同的颜色是染料分子不同带电状态的结果。

　　当pH值小于0时，考马斯蓝G250染料会腐蚀所有带正电荷的三个氮原子，颜色为红色最大吸收波长为465nm。当pH值约为1时，染料的总电荷为+1(2-磺酸基团带负电，因为它们的pKa极低)，所以染料是绿色的，具有吸收能力最大值为620nm，而pH值高于2时，染料为亮蓝色，最大值为595nm。在pH值为7时,二苯/胺部分带正电荷，总电荷为−1，染料消光系数为43 000 M−1厘米−1.

　　染料与蛋白质的氨基和羧基(非共价)静电相互作用，因此主要来自碱性氨基酸(主要是精氨酸、赖氨酸、组氨酸)，以及疏水性氨基酸(苯丙氨酸，酪氨酸、色氨酸)。当在pH=3.0的0.01M柠檬酸盐缓冲液中溶解时，考马斯的最大吸收波长为555nm;蛋白质-染料复合物的特征是峰略宽于游离染料的峰，最大值为549nm。

　　考马斯凝胶染色剂和布拉德福德蛋白质分析试剂是以25-50%甲醇中的极酸性溶液配制的。在酸性条件下，染料主要通过碱性氨基酸(主要是精氨酸、赖氨酸和组氨酸)与蛋白质结合，而络合物的形成稳定了产生蓝色的染料的负电荷阴离子形式。每个蛋白质分子结合的考马斯染色配体的数量约为与蛋白质上发现的正电荷数成正比。蛋白质结合导致染料从红棕色至亮蓝色(最大吸收波长为595nm)。

　　考马斯蓝G-250染料的水溶性在胶体考马斯染色方案中得到了很好的应用。

　　溶液中蛋白质测定-布拉德福德法

　　1. 着色溶液成分：5%考马斯蓝G250

　　2. 着色溶液制备：

　　a.将50mg考马斯蓝G250溶于50ml甲醇中

　　b.从步骤1开始向溶液中加入100ml 85%H3PO4

　　c.将步骤2的溶液加入500ml H2O中，混匀

　　d.过滤以去除任何沉淀物

　　e.再添加350ml H2O和miw 储存于4°C。

　　3. 分析流程20-150 µg 蛋白; 200-1500 µg/mL

　　a. 准备0.15M NaCl溶液稀释至最终浓度为250、，500、750和1500微克/毫升浓度。同时准备待测样品稀释液。

　　b. 向单独的试管(或分光光度计试管)中添加100µL蛋白至以上浓度NaCl稀释液中。

　　c. 再向每个试管中添加5.0mL考马斯蓝，通过涡流或倒置进行混合。

　　d. 将分光光度计调整到595nm的波长，并使用不含蛋白质的试管进行空白。

　　e. 等待5分钟，在595nm波长下读取每个标准和每个样品。

　　f. 绘制标准溶液的吸光度与蛋白浓度的关系。计算消光系数并计算未知样本的浓度。

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