ELISA实验—试剂盒实验基本知识点

　　基本类型:

　　酶联免疫吸附试验 (以下简称ELISA) ：是酶免疫测定技术中应用的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原-抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。

　　用途:

　　根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA，即我们通常所指的ELISA(微量板ELISA);另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA,称为斑点ELISA(Dot-ELISA);再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA，称为布ELISA(C-ELISA)。在微量板ELISA中，又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。

　　操作程序:

　　1、间接ELISA

　　本法主要用于检测抗体。以鸭病毒性肝炎(DVH)抗体的ELISA为例，间接ELISA的操作程序如下：

　　(1) 材料

　　① 包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液;

　　② DVH包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性DVH参考血清;待检鸭血清;

　　③ ELISA检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。

　　(2) 方法步骤

　　① 加抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

　　② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干

　　③ 加酶标抗体 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干

　　④ 加底物液 → 37℃ 30分钟，加终止液

　　⑤ 用ELISA检测仪测定OD值，并计算出P/N比值。

　　(3) 结果判定 已知阳性血清与已知阴性血清的比值(P/N)≥2.1，而且已知阳性血清的OD值≥0.4;在上述条件成立的情况下，如果待检血清与已知阴性血清的比值(P/N)≥2.1，而且待检血清的OD值≥0.4，则判为阳性，否则判为阴性。

　　2、双抗体夹心ELISA

　　本法主要用于检测大分子抗原。现以检测鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的双夹心抗体ELISA为例介绍本法的操作程序。

　　① 加抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

　　② 加待检抗原 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干

　　③ 加酶标抗体 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干

　　④ 加底物液 → 37℃ 15分钟，加终止液

　　⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。

　　3、双夹心ELISA

　　此法与双抗体夹心ELISA的主要区别在于：它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原，它不仅不必标记每一种抗体，还可提高试验的敏感性。

　　此法的基本程序为：

　　① 加抗体(Ab-1)包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

　　② 加待检抗原(Ag) → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

　　③ 加用非同种动物生产的特异性抗体(Ab-2)→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

　　④ 加入酶标抗Ab-2抗体(AB-3)→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

　　⑤ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液

　　⑥ 用ELISA检测仪测定OD值。

　　4、竞争ELISA

　　此法主要用于测定小分子抗原及半抗原，其原理类似于放射免疫测定。

　　其基本程序为：

　　① 抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

　　② 加入待检抗原及一定量的酶标抗原(对照孔仅加酶标抗原)→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

　　③ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液

　　④ 用ELISA检测仪测定OD值。

　　被结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定，如果待检溶液中抗原越多，被结合的标记抗原的量就越少，有色产物就减少，这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测;其主要不足在于每种抗原都要进行酶标记，而且因为抗原的结构不同，还需应用不同的结合方法。此外，试验中应用酶标抗原的量较多。

　　5、阻断ELISA

　　本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎(TGE)、猪伪狂犬病(PR)及猪胸膜肺炎(AP)的主要检测方法。

　　下面以AP2型抗体的阻断ELISA检测法为例介绍其操作程序：

　　① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干

　　② 用200μl阻断缓冲液进行封闭 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

　　③ 加工作量1:4稀释被检猪血清100μl → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

　　④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干

　　⑤ 加100μl工作量猪抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干

　　⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液

　　⑦ 用ELISA检测仪测定OD值。

　　本试验同时设标准阴、阳性血清对照、兔抗AP2型阳性对照、空白对照。

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