ELISA试验中吸光值(OD值)普遍偏高可能由多种因素引起，以下是本生技术小编对常见原因及对应的解决方案：

　　一、常见原因及解决办法

　　1. 抗体或抗原浓度过高

　　原因：捕获抗体、检测抗体或抗原浓度过高，导致信号过强。

　　解决：

　　优化抗体/抗原浓度，通过棋盘滴定法确定最佳稀释比例。

　　重新评估标准曲线的浓度范围。

　　2. 酶标抗体过量或孵育时间过长

　　原因：酶标抗体浓度过高或孵育时间过长，导致底物过度催化。

　　解决：

　　稀释酶标抗体或缩短孵育时间(建议参考说明书并优化条件)。

　　严格按标准操作流程控制反应时间。

　　3. 底物反应时间过长

　　原因：底物(如TMB)显色时间超出推荐范围，导致颜色过深。

　　解决：

　　严格控制显色时间(通常TMB为10-15分钟)。

　　显色后立即终止反应(加入终止液)，并在规定时间内读数(如10分钟内)。

　　4. 洗涤不充分

　　原因：未结合的抗体或酶标物残留，增加背景信号。

　　解决：

　　增加洗涤次数(通常3-5次)。

　　确保每孔洗涤液充分填满和排空，可使用自动洗板机优化程序。

　　5. 样本或试剂污染

　　原因：样本中存在干扰物质(如溶血、脂血)、试剂污染或交叉污染。

　　解决：

　　离心去除颗粒物，过滤或稀释高脂样本。

　　更换新试剂，避免试剂交叉污染。

　　6. 板孔干燥或密封不当

　　原因：孵育过程中板孔干燥，导致非特异性结合增加。

　　解决：

　　孵育时使用封板膜密封板孔，避免长时间暴露。

　　控制孵育湿度(如放置在湿盒中)。

　　7. 仪器或读数错误

　　原因：酶标仪波长设置错误(如TMB应为450nm，校正波长630nm)或校准异常。

　　解决：

　　核对酶标仪波长是否正确，定期校准仪器。

　　确保板底清洁无划痕，避免光学干扰。

　　8. 非特异性结合(高背景)

　　原因：封闭不充分或封闭蛋白与抗体交叉反应。

　　解决：

　　更换封闭剂(如使用BSA、脱脂奶粉或商业化封闭液)。

　　延长封闭时间(通常1-2小时)或提高封闭剂浓度(如5% BSA)。

　　9. 标准品或试剂失效

　　原因：标准品降解、底物溶液变质(如TMB暴露于光线下)。

　　解决：

　　检查试剂有效期，避光保存底物。

　　重新配制标准品或更换新试剂。

　　二、系统性排查步骤

　　空白对照检查：确认空白孔(仅底物+终止液)OD值是否正常(通常<0.1)。

　　梯度稀释验证：对样本或标准品进行稀释，观察OD值变化是否符合预期。

　　重复实验：更换新试剂/板条重复实验，排除偶然误差。

　　对照孔分析：检查阴性对照是否正常，排除背景干扰。

　　三、预防措施

　　严格遵循试剂说明书操作，优化实验条件。

　　定期校准仪器，确保环境温湿度稳定。

　　记录每次实验细节(孵育时间、洗涤次数等)，便于追溯问题。

　　通过以上方法逐步排查，可有效解决OD值偏高的问题。若问题持续，建议联系试剂厂家技术支持。

　　注：以上资料仅供参考，如需进一步了解产品详情，可参考品牌供应商或技术老师。

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