Elisa实验：加酶标抗体操作

　　以下是ELISA实验中‌加酶标抗体‌操作的详细步骤及注意事项，综合整理自实验指南：

　　一、操作步骤

　　抗体稀释‌

　　使用封闭液(如5% BSA或脱脂奶粉)稀释酶标抗体至工作浓度(通常1:1000~1:50000)。

　　稀释后需充分混匀，避免气泡产生。

　　加样与孵育‌

　　每孔加入100 μL稀释后的酶标抗体，避免触碰孔壁或产生气泡。

　　37℃孵育30-60分钟(时间根据说明书调整)。

　　洗涤‌

　　弃去孔内液体，用PBST(含0.05% Tween-20的PBS)洗涤3-5次，每次浸泡1-2分钟并拍干。

　　手工洗板时需垂直拍板，避免交叉污染。

　　二、关键注意事项

　　抗体选择‌

　　夹心法：需确保酶标抗体与包被抗体靶向抗原的不同表位，避免竞争结合。

　　间接法：酶标二抗需与一抗种属匹配(如兔抗鼠IgG-HRP)。

　　质量控制‌

　　设置空白对照(仅加稀释液)和阴性对照(非特异性抗体)，排除背景干扰。

　　显色后若整板OD值偏低，需检查酶标抗体活性或稀释比例。

　　其他要点‌

　　酶标抗体需避光保存，现用现配。

　　竞争法中，酶标抗原与待测抗原需同步加入。

　　三、常见问题处理

　　非特异性结合‌：增加封闭时间(2小时以上)或更换封闭液(如5%脱脂奶粉)。

　　复孔差异大‌：检查移液器校准及操作一致性。

　　注：以上资料仅供参考，如需具体品牌说明可进一步提供货号查询详细参数。

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