以下是本生技术小编对ELISA试剂盒实验操作的规范详解，结合双抗体夹心法的通用流程及注意事项：

　　一、实验前准备‌

　　试剂平衡‌

　　试剂盒从冰箱取出后，需室温平衡20-30分钟(避免温度差异影响反应)‌。

　　设备校准‌

　　移液器需定期校准，选择密封性好的枪头，避免加样误差(误差可超5%)‌。

　　二、加样规范‌

　　标准品与样本处理‌

　　标准品需按说明书涡旋溶解，静置10-30分钟至溶解，避免吹打导致蛋白损失‌。

　　样本需离心(2000×g，15分钟)去除颗粒物，血清/血浆避免溶血或脂血干扰‌。

　　加样操作‌

　　垂直悬空加液，避免贴壁或产生气泡，每孔加样量需一致(如50μL标准品或样本)‌。

　　建议设置复孔(至少2孔/样本)，提高数据可靠性‌。

　　三、孵育与洗涤‌

　　孵育条件‌

　　37℃恒温箱孵育60分钟(双抗体夹心法)，封板膜密封防止蒸发‌。

　　震荡孵育可增强抗原抗体结合效率(OD值更高)‌。

　　洗涤步骤‌

　　手工洗板：每孔加满洗涤液(350μL)，静置1分钟后拍干，重复5次‌。

　　机器洗板：检查冲洗头是否堵塞，确保洗涤净。

　　四、显色与检测‌

　　底物反应‌

　　加入TMB底物后避光孵育15分钟，显色呈蓝色‌。

　　终止液加入后5分钟内测定OD值(450nm)，避免延迟导致信号衰减‌。

　　数据计算‌

　　标准曲线需线性良好(R²≥0.99)，样本浓度通过曲线方程计算‌。

　　五、常见问题与解决‌

　　问题‌ ‌可能原因‌ ‌解决方案‌

　　空白孔OD值过高 洗涤不净或试剂污染 更换新鲜洗涤液，重复洗板‌

　　平行孔CV值>10% 加样误差或孵育温度波动 校准移液器，使用恒温箱‌

　　显色不均匀 底物混合不充分 显色前充分摇匀试剂‌

　　六、关键注意事项‌

　　试剂保存‌：未用完板条需密封干燥保存，浓缩洗涤液结晶需37℃水浴溶解‌。

　　样本稀释‌：若说明书要求稀释样本(如5倍)，最终结果需乘以稀释倍数‌。

　　以上规范适用于多数ELISA试剂盒，具体操作需以试剂盒说明书为准。实验失败时建议优先检查加样精度和洗涤步骤‌。

　　注：以上资料仅供参考，具体其他信息请咨询技术老师或品牌供应商。

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