elisa实验：常见问题及分析

　　ELISA实验常见问题及分析

　　1. 背景颜色深/非特异性染色

　　原因‌：洗涤不充分、试剂污染、孵育时间过长或抗体浓度过高‌。

　　解决方法‌：确保洗涤液注满微孔且无残留，更换吸头避免交叉污染，严格按说明书控制孵育和显色时间‌。

　　2. 所有孔均无明显颜色

　　原因‌：试剂混淆、酶标物失活或步骤遗漏‌。

　　解决方法‌：检查试剂标签，确认无遗漏步骤，使用新鲜蒸馏水配制缓冲液，确保试剂室温平衡30分钟‌。

　　3. 假阳性，背景高甚至花板

　　原因‌：加样时污染、温育箱温度过高、操作时间过长导致反应时间不同、洗板不充分‌。

　　解决方法‌：更换枪头避免污染，控制温育箱温度在37±0.5℃，在尽可能短的时间内完成操作，避免堆积板子‌。

　　4. 重复性不好

　　原因‌：加样量不一、操作时间不一致、操作人员不同、标本处理不同‌。

　　解决方法‌：确保加样量与时间一致，使用同一名操作人员，模拟相同的反应条件‌。

　　5. 标准曲线不佳

　　可能原因‌：倍比标准品时未充分混匀、标准品溶液配置有误或标准品已降解‌。

　　解决方法‌：使用校准过的移液器，快速、等量分配标准品，确认稀释正确，并按推荐方式保存和处理标准品‌。

　　6. 样本无检测信号

　　可能原因‌：样本中无检测物或检测物含量极低、样本中其他物质影响/掩盖检测、样本中检测物浓度过高，Hook效应导致假低值‌。

　　解决方法‌：设置内参，重新实验，对样本进行适当稀释，降低其他物质的干扰‌。

　　7. 阴性对照出现阳性结果

　　可能原因‌：试剂/样品污染、夹心ELISA-检测抗体与包被抗体反应、酶标板洗板不净‌。

　　解决方法‌：使用新鲜试剂，小心操作移液器，确定使用的是正确的包被抗体和检测抗体‌。

　　8. 酶标板整体背景高

　　可能原因‌：结合反应太强或时间过长、底物溶液或终止液不是新鲜配制的、没有终止反应‌。

　　解决方法‌：检查底物的稀释，使用建议的稀释度，当酶标仪显色足够进行吸光度读取是立即用终止液终止反应‌。

　　9. 吸光度数值低

　　可能原因‌：使用的样品中没有显示靶蛋白或者靶蛋白显示的水平低、抗体不足‌。

　　解决方法‌：检查靶蛋白表达系统，确保它在您的样品中被表达出来，确定使用的是建议的抗体量‌。

　　10. 吸光值高

　　可能原因‌：样品和/或阳性对照吸光度数高，吸光度没有按样品在板上的稀释梯度递减‌。

　　解决方法‌：样品或阳性对照的浓度过高，超出了实验方法检测的范围，重新设置实验方法或者在加样前稀释降低样品和对照的浓度‌。

　　11. 满板白，阳性对照不显色

　　可能原因‌：把终止液误当作酶结合物或底物使用、漏加或错加试剂‌。

　　解决方法‌：严格按说明书操作，加液时看准标签，换用合格的蒸馏水或去离子水‌。

　　12. 满板显色

　　可能原因‌：读板前停留时间过长、加显色剂后在温育时受强光或紫外线照射‌。

　　解决方法‌：加终止液后10分钟内测定结果，应保存在暗处，避光‌。

　　注：以上仅供参考，本试剂仅供科研使用，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。

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