猪补体蛋白3(C3)ELISA试剂盒操作说明

　　猪补体蛋白3(C3)ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法，以下是操作说明，可参考(不同品牌的产品请以品牌商盒子中带说明书为准)：‌

　　BS-4532   猪补体蛋白3(C3)ELISA试剂盒   96T/48T

　　一、检测原理

　　试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验，往预先包被补体蛋白3(C3)抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并洗涤后，用底物TMB显色;TMB在过氧化物酶催化下转化为蓝色，最终在酸的作用下转为黄色，颜色深浅和样本中C3含量呈正相关，通过酶标仪测定450nm波长的吸光度(OD值)，即可计算样本浓度。

　　二、试剂盒组成(以96孔配置为例)

　　名称 规格

　　微孔酶标板 12孔×8条(已预包被抗体)

　　标准品 0.3mL×6管(浓度：0、5、10、20、40、80μg/mL)

　　样本稀释液 6mL

　　检测抗体-HRP 10mL

　　20×洗涤缓冲液 25mL

　　底物A、底物B 各6mL

　　终止液 6mL

　　封板膜、自封袋、说明书 配套配置

　　三、样本处理要求

　　血清‌：使用不含热原/内毒素的试管，收集血液后3000转离心10分钟分离血清和红细胞;也可室温自然凝固10-20分钟，2000-3000转/分离心20分钟，沉淀需再次离心收集上清

　　血浆‌：选择EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝，3000转离心30分钟取上清

　　细胞上清液‌：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物后取上清;若检测细胞内成分，用PBS稀释细胞悬液至100万/ml，反复冻融破坏细胞后离心取上清

　　组织匀浆‌：将组织加入生理盐水捣碎，3000转离心10分钟取上清

　　保存注意‌：样本不及时检测需按单次用量分装冻存于-20℃，避免反复冻融，解冻后需确保样本充分混匀

　　四、试剂准备

　　洗涤缓冲液稀释‌：按1:20比例用蒸馏水稀释20×洗涤缓冲液(1份浓缩洗涤液加19份蒸馏水)

　　试剂盒平衡‌：从冰箱取出试剂盒，室温平衡20分钟后再使用;浓缩洗涤液若有结晶，水浴加热使结晶溶解后再配置

　　五、操作步骤

　　从室温平衡后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回2-8℃冰箱保存

　　设置标准品孔和样本孔：标准品孔各加入不同浓度的标准品50μL;样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL(最终结果需乘以5校正稀释倍数);空白孔不加样

　　除空白孔外，标准品孔和样本孔每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴/恒温箱温育60分钟

　　弃去孔内液体，在吸水纸上拍干;每孔加满洗涤液，静置1分钟后甩去洗涤液，再次拍干，重复洗板5次(也可使用自动洗板机完成)

　　每孔加入底物A、底物B各50μL，37℃避光孵育15分钟

　　每孔加入终止液50μL，15分钟内，在酶标仪450nm波长处测定各孔的OD值

　　六、结果计算

　　在Excel中以标准品浓度为横坐标，对应OD值为纵坐标，绘制标准线性回归曲线，根据曲线方程计算各样本的浓度值;若样本经稀释，最终结果乘以稀释倍数即可得到实际浓度

　　七、注意事项

　　试剂盒仅用于科研实验

　　不同批次试剂不可混用，实验后剩余未使用试剂需按要求密封低温保存

　　严格按照说明书规定的温育时间、加液量操作，所有液体组分使用前需充分摇匀

　　不能检测含NaN₃的样品，NaN₃会抑制辣根过氧化物酶活性，导致结果偏差

　　注：以上科研耗材资料供参考!