本生分享实验技巧：ELISA各个操作步骤的注意要点

　　ELISA实验每个步骤的注意要点，直接关系到实验结果的准确性，本生BUNSEN小编分步骤整理如下：

　　一、实验前准备

　　所有试剂提前从冷藏环境取出，‌平衡至室温(20-25℃)‌再使用，避免低温影响抗原抗体结合效率;未开封试剂需在2-8℃避光保存，标准品建议分装冻存，避免反复冻融降解。本生BUNSEN试剂盒

　　实验前检查移液器校准情况，多通道移液器需逐孔校准移液体积，避免移液误差导致结果偏差。

　　提前确认洗涤液浓度是否正确，若出现结晶需充分溶解混匀后再使用。

　　二、包被步骤

　　包被抗原/抗体需用‌碳酸盐缓冲液(pH9.6)‌稀释，浓度需通过预实验确定，浓度过高会增加非特异性背景，过低会导致信号不足。

　　包被时保证每孔加液均匀，避免触碰孔底刮伤包被面;包被后建议4℃‌静置过夜(12-16小时)‌，比37℃孵育结合更稳定，背景更低。

　　包被完成后立即吸干孔内液体，立刻加入封闭液，避免孔底干燥导致封闭不均。

　　三、封闭步骤

　　封闭液选择需匹配实验体系：一般检测用5%脱脂奶粉，磷酸化蛋白检测推荐用1% BSA(脱脂奶粉含磷酸化酶会干扰结果)。

　　封闭时间至少1-2小时，推荐室温封闭，避免4℃封闭时间过长导致包被物脱落;封闭后充分洗涤3次，去除未结合的封闭蛋白。

　　四、加样步骤

　　加样时枪头不要触碰孔壁和孔底，避免戳掉包被物;每加完一个样本更换一次枪头，避免交叉污染。

　　加样速度保持均匀，避免液体溅出或产生气泡，若出现气泡可轻轻用枪头戳破，避免气泡影响后续读数。

　　样本加样后轻轻震动酶标板，确保样本均匀覆盖孔底，避免局部结合不均匀。

　　五、孵育步骤

　　孵育必须在‌湿润环境‌中进行，可在孵育盒底部垫湿润滤纸，避免孔内液体蒸发导致浓度偏差。

　　严格按照说明书控制孵育时间，不要随意延长，延长会增加非特异性结合导致背景升高。

　　37℃孵育需密封孵育盒，避免冷凝水滴入孔内，导致样本浓度被稀释。

　　六、洗涤步骤

　　洗涤是降低背景的核心步骤，每次洗涤需注满每孔，浸泡30秒后再吸干，重复洗涤至少3-5次。

　　每次洗涤完成后，将酶标板倒置在干净吸水纸上用力拍干，去除孔内残留未结合物。

　　全自动洗板机使用后需定期清理管道，避免残留盐分堵塞管道，导致洗涤不充分。

　　七、显色步骤

　　底物溶液需现配现用，避光保存，避免提前氧化失效;加入底物时避免光照，显色过程建议避光孵育。

　　显色时间需通过预实验控制，不要过度显色，当阳性对照出现明显颜色即可终止，过度显色会升高背景。

　　加入底物后观察显色均匀性，如果出现不显色斑块，多是洗涤时刮伤包被面导致，实验结果需作废。

　　八、终止与读数

　　终止液加入顺序和速度尽量和底物保持一致，确保每个孔终止反应时间一致;终止后15分钟内必须完成读数，超过时间产物会褪色，导致OD值偏低。

　　读数前需擦干净酶标板底部，去除指纹、水渍，避免干扰透光率导致读数误差;设置双波长读数(测量波长+参比波长)，可有效降低背景噪音。

　　注：以上科研产品资料供参考，具体可咨询技术老师!

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