以下是‌大鼠骨特异性碱性磷酸酶(ALP)ELISA试剂盒‌的实验使用说明书，综合操作流程、注意事项及技术要点：

　　BS-3487  大鼠骨特异性碱性磷酸酶(ALP)ELISA试剂盒

　　一、实验原理‌

　　采用‌双抗体夹心法‌：

　　包被微孔板的大鼠ALP捕获抗体与样本中的ALP结合‌。

　　加入HRP标记的检测抗体，形成“抗体-抗原-酶标抗体"复合物‌。

　　TMB显色，颜色深浅与ALP浓度正相关，450nm测OD值‌。

　　二、样本处理‌

　　血清/血浆‌：

　　采集后3000rpm离心10-20分钟，避免溶血‌。

　　抗凝剂可选EDTA、肝素或柠檬酸盐‌。

　　组织匀浆‌：

　　加入PBS匀浆，3000rpm离心10分钟取上清‌。

　　细胞上清液‌：

　　离心去除颗粒，避免反复冻融‌。

　　保存‌：

　　短期存于2-8℃，长期需-20℃保存，避免多次冻融‌。

　　三、操作步骤‌

　　标准品稀释‌：

　　按说明书梯度稀释(如40IU/L→2.5IU/L)‌。

　　加样‌：

　　空白孔不加样，标准孔加50μl标准品，样本孔先加40μl稀释液+10μl样本(5倍稀释)‌。

　　温育‌：

　　37℃孵育30分钟，封板膜密封‌。

　　洗涤‌：

　　用稀释后的洗涤液洗板5次，拍干‌。

　　加酶标抗体‌：

　　每孔50μl(空白孔除外)，37℃复育30分钟‌。

　　显色与终止‌：

　　依次加入显色剂A/B各50μl，避光显色15分钟，终止液50μl终止反应‌。

　　检测‌：

　　450nm测OD值，15分钟内完成‌。

　　四、注意事项‌

　　试剂准备‌：

　　使用前平衡至室温(15-30分钟)，浓缩洗涤液需37℃助溶‌。

　　加样精度‌：

　　使用校准加样器，避免孔壁接触，5分钟内完成加样‌。

　　质量控制‌：

　　每次实验需做标准曲线及复孔，样本OD值超标准曲线时需稀释‌。

　　干扰因素‌：

　　避免使用NaN3(抑制HRP活性)或高脂样本‌。

　　五、结果计算‌

　　以标准品浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制曲线，拟合方程计算样本ALP浓度‌。

　　以上操作需严格遵循试剂盒说明书，不同批次可能存在差异‌。

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