大鼠CD9分子(CD9)ELISA试剂盒实验使用说明书

　　BS-3493大鼠CD9分子(CD9)ELISA试剂盒

　　实验原理

　　本试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被大鼠CD9分子捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠CD9分子(CD9)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。

　　样本处理及要求

　　血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

　　血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

　　组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比)加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。

　　实验操作步骤

　　准备工作：从冰箱中取出试剂盒，待其平衡至室温(20-25℃)，确保试剂盒内各组分达到最佳反应状态。将未使用的板条连同干燥剂一同放回铝箔袋内，密封后保存于4℃冰箱中。

　　加入标准品与检测样本：依据试剂盒说明书要求，选用适宜的溶液对标准品进行稀释，制备出一系列具有明确浓度梯度的标准品工作液。使用移液器精准地将标准品工作液和检测样本分别加入到ELISA板的对应孔中，每孔加入量严格控制在100μl。将加样后的ELISA板置于37℃恒温环境，避光孵育90分钟。

　　洗板：孵育结束后，取出ELISA板，用洗板液以轻柔且均匀的力度轻轻洗涤5次，每次洗涤持续30秒。每次洗涤后，将洗板液倒出，随后用吸水纸轻轻拍干板底。

　　加入生物素化抗体工作液：将生物素化抗体工作液准确加入到每个孔中，每孔加入量为100μl;对于空白孔，则加入100μl生物素化抗体稀释液。将ELISA板放回37℃恒温环境，继续避光孵育60分钟。

　　加入酶结合物工作液：将酶结合物工作液精准地加入到每个孔中，每孔加入量为100μl;空白孔则加入100μl酶结合物稀释液。

　　注意事项

　　CD9在部分组织和细胞株系表达，并且其表达量在不同组织和细胞株系也有差别，建议设置阳性对照。

　　CD9是一个多次跨膜蛋白，强烈建议提取蛋白时不煮样，防止蛋白聚集;表达量较低的细胞可通过提取膜蛋白富集靶标蛋白。

　　在对外泌体进行CD9检测时，CD9的蛋白丰度十分重要，若提取的外泌体中CD9含量较低，易出现无信号现象。

　　CD9是一个蛋白分子量比较小的蛋白，建议在电泳和转膜时根据小分子蛋白操作流程进行实验。

　　注：以上资料仅供参考，具体请咨询技术老师。

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