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BS-4401 鸡胰蛋白酶(trypsin)ELISA试剂盒
本试剂盒仅供研究使用，不用于临床诊断。
1. 简介：
鸡胰蛋白酶（Trypsin）是一种丝氨酸蛋白酶，在禽类消化和生理过程中起着关键作用。本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（Sandwich ELISA）定量检测鸡血清、血浆、细胞培养上清液或其他生物液体样本中的胰蛋白酶浓度。
2. 实验原理：
本实验采用双抗体夹心法。
将特异性抗鸡Trypsin抗体预包被在微孔板上。
加入样本和标准品，其中的Trypsin会与孔板上的捕获抗体结合。
洗板后，加入生物素标记的检测抗体，与Trypsin的另一位点结合，形成“抗体-抗原-抗体"复合物。
再次洗板后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素（Streptavidin），后者会与生物素特异性结合。
加入底物TMB显色液，在HRP的催化下产生蓝色产物，加入终止液后变为黄色。
用酶标仪在450 nm波长下测量各孔的吸光度（OD值），其颜色深浅与样本中的Trypsin浓度成正比。通过绘制标准曲线，即可计算出样本中Trypsin的实际浓度。
（注：请于收到试剂盒后核对各组分数量，并参照标签说明进行保存。）
| 组分名称 | 规格 (96T) | 保存条件 |
|---|---|---|
| 预包被微孔板 | 12条×8孔 | 2-8℃干燥保存 |
| 鸡Trypsin标准品 | 冻干粉或液体 | -20℃保存（按说明书复溶或稀释） |
| 样本稀释液 | 30 mL | 2-8℃保存 |
| 生物素标记检测抗体 | 10-15 mL | 2-8℃保存（避免光照） |
| HRP标记的链霉亲和素 | 10-15 mL | 2-8℃保存（避免光照） |
| 浓缩洗涤液 (20X) | 50 mL | 2-8℃保存（使用前需稀释） |
| TMB底物溶液 | 10-15 mL | 2-8℃避光保存 |
| 终止液 (2M H₂SO₄) | 10-15 mL | 2-8℃保存 |
| 封板膜 | 4-6张 | 室温 |
| 说明书 | 1份 | 室温 |
酶标仪（450 nm滤光片）
精密移液器及一次性吸头
涡旋混合器
37℃恒温孵育箱
洗板机或手动洗板设备（多道移液器）
蒸馏水或去离子水
用于稀释标准品和样本的试管、EP管
吸水纸
平衡室温：将所有试剂（除标准品外）取出，平衡至室温（18-25℃）约30分钟后再使用。
配制洗涤液：将浓缩洗涤液（20X） 用蒸馏水或去离子水按 1:19 稀释，即1份浓缩洗涤液加19份水，混匀后即为工作浓度洗涤液。
配制标准品：
若标准品为冻干粉：加入指定体积的样本稀释液进行复溶，静置片刻，轻轻涡旋混匀。此溶液为最高浓度标准品（Stock）。
若标准品为液体：直接进行系列稀释。
按照说明书要求，用样本稀释液进行倍比稀释，制备一系列不同浓度的标准品点（例如：1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 pg/mL）。通常设置7个标准品点和一个零点（样本稀释液作为空白孔）。
稀释样本：根据预实验或文献报道，用样本稀释液对未知样本进行适当稀释（如10倍、100倍稀释）。建议初次实验设置多个稀释度，以确保OD值落在标准曲线线性范围内。
总流程概要： 加样 → 孵育 → 洗板 → 加检测抗体 → 孵育 → 洗板 → 加酶结合物 → 孵育 → 洗板 → 显色 → 终止 → 检测
加样：
设置标准品孔、样本孔和空白孔（Blank）。
标准品孔：加入不同浓度的标准品100 μL。
样本孔：加入已稀释的待测样本100 μL。
空白孔：加入样本稀释液100 μL。
注意：每个标准和样本建议设2-3个复孔。
盖上封板膜，在37℃下孵育90分钟。
洗板：
小心揭掉封板膜，弃去孔内液体。
每孔加满工作洗涤液（约350 μL），静置30秒后弃去，如此重复洗板3次。
最后一次洗板后，在吸水纸上拍干，确保无液体残留。
加检测抗体：
除空白孔外，每孔加入生物素标记的检测抗体100 μL。
盖上新的封板膜，在37℃下孵育60分钟。
洗板：
重复步骤2的洗板过程，共洗板3次。
加酶结合物：
每孔（包括空白孔）加入HRP标记的链霉亲和素100 μL。
盖上新的封板膜，在37℃下孵育30分钟（避免光照）。
洗板：
重复步骤2的洗板过程，共洗板5次（此步需更净，减少非特异性结合）。
显色：
每孔（包括空白孔）加入TMB底物溶液90 μL。
盖上封板膜，在37℃避光条件下显色15-20分钟。期间密切观察标准品孔的颜色变化（出现梯度蓝色）。
终止：
当最高浓度标准品孔呈现明显的蓝色，且梯度良好时，每孔加入终止液50 μL。溶液颜色立即由蓝变黄。
检测：
在加入终止液后15分钟内，用酶标仪在450 nm波长下测量各孔的吸光度（OD值）。
设置：先用空白孔调零。
计算每个标准品和样本复孔的平均OD值。
以标准品的浓度为横坐标（X轴），对应的平均OD值为纵坐标（Y轴），在半对数坐标纸上或用软件（如Excel，选择四参数 logistic (4-PL) 曲线拟合）绘制标准曲线。
将样本的平均OD值代入标准曲线方程，计算出对应的浓度（X值）。
重要：计算出的样本浓度必须再乘以样本的稀释倍数，才能得到样本中Trypsin的实际浓度。
安全第一：终止液为稀硫酸，具有腐蚀性，请佩戴手套和护目镜操作。如不慎接触皮肤，立即用大量清水冲洗。
试剂保存：未使用的板条应立即放回带有干燥剂的铝箔袋中密封，2-8℃保存。TMB和酶结合物对光敏感，需避光保存。
操作规范：精确的移液和的洗板是实验成功的关键。避免交叉污染。
时效性：所有试剂应在有效期内使用。复溶后的标准品分装冻存于-20℃，避免反复冻融。
线性范围：如果样本OD值超出标准曲线最高点，请增加稀释倍数后重新检测。
质量控制：建议每次实验都运行标准曲线，并设置质控样本。
注：以上资料仅供参考，不作为实际数据，如需其他请咨询技术老师或品牌供应商。
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