本试剂盒采用双抗体夹心法原理，通过预包被抗大鼠HIF-1α单克隆抗体的酶标板捕获样本中的目标蛋白。检测流程包括：样本与捕获抗体孵育形成抗原-抗体复合物后，依次加入生物素化二抗和HRP-链霉亲和素进行信号放大，最终通过TMB显色反应在450nm波长下测定吸光度值。该设计实现了对血清、血浆及组织匀浆中pg/mL级HIF-1α的高灵敏度检测，其浓度与OD值呈正相关。试剂盒保存条件建议为-20℃长期储存(6个月有效期)，频繁使用时短期存放于2-8℃。

　　试剂盒核心组件包括：

　　1) 预包被酶标板，采用抗大鼠HIF-1α单克隆抗体固化于96孔板，确保高亲和力捕获;

　　2) 标准品，提供0-64 pg/mL梯度浓度冻干品，用于绘制标准曲线;

　　3) 检测抗体系统，含生物素化二抗及HRP-链霉亲和素复合物，实现信号放大

　　4) 显色试剂，含TMB底物和终止液，显色反应在10-30分钟内完成

　　5) 配套缓冲液，包括浓缩洗涤液(25×)、样品稀释液及酶结合物稀释液，需按说明书稀释使用。所有组分需严格避光保存，其中酶标板、标准品及HRP结合物建议-20℃长期保存，短期使用可置于2-8℃。

　　样本处理需遵循以下规范：

　　1) 血清/血浆采集后室温静置10-20分钟，2000-3000转/分钟离心20分钟去除纤维蛋白原，取上清液立即检测或分装保存于-80℃;

　　2) 组织匀浆按1:9比例加入预冷PBS，用匀浆器研磨后4℃离心(3000-5000转/分钟)10分钟，取上清液检测。所有样本避免反复冻融，溶血、脂血或微生物污染的样本可能导致假阳性。稀释液推荐使用试剂盒配套的缓冲体系，避免离子强度差异影响结合效率。特殊样本需通过预实验验证回收率，必要时调整稀释倍数。

　　试剂盒性能指标如下：

　　1) 灵敏度，检测限达16-43 pg/mL，可精准识别低丰度样本

　　2) 特异性，抗大鼠HIF-1α抗体无交叉反应，与HIF-1β等相似蛋白无结合

　　3) 精密度，板内变异系数(CV)<10%，板间CV<15%，符合定量分析要求

　　4) 线性范围，标准曲线覆盖0-64 pg/mL，R²值≥0.99;5)回收率，在80%-120%范围内，验证样本基质兼容性。建议每批次实验设置复孔及质控样本(如添加标准品的临床样本)，确保数据可靠性。

　　实验操作需严格遵循以下步骤：

　　1) 标准品梯度稀释，将冻干标准品用稀释液复溶后，按64→0 pg/mL等比稀释，每个浓度设双孔;

　　2) 加样与孵育，每孔加入100μL标准品/样本，37℃孵育90分钟，洗板3次去除未结合物。

　　3) 酶结合物反应，加入生物素化抗体100μL，37℃孵育60分钟后洗涤，再加入HRP-链霉亲和素100μL，避光孵育30分钟。

　　4) 显色与终止，每孔加入TMB底物100μL，室温避光反应15分钟，最后加入50μL终止液终止反应。关键注意事项包括：孵育时间误差控制在±5分钟内，洗涤时确保每孔注满洗涤液并充分拍干，避免气泡干扰读数。建议使用多通道移液器加样，减少操作差异。数据分析需采用四参数逻辑回归拟合标准曲线，通过酶标仪450nm波长测定各孔OD值。计算时需扣除空白孔背景值，样本浓度通过标准曲线插值获得，超出线性范围需重新稀释后检测。典型结果表现为：标准品OD值随浓度升高呈梯度变化，阴性对照OD值应<0.1，临界值(Cut-off)通常为阴性对照平均OD值的2.1倍。

　　异常数据排查建议：

　　1) 复孔CV>15%时需重复实验;

　　2) 标准曲线R²<0.95时检查稀释准确性;

　　3) 高背景值可能因洗涤或试剂污染导。最终报告需标注检测范围、稀释倍数及质控数据，确保结果可追溯。

　　注：以上仅供参考，不作为实际数据，实验需严格

　　遵循说明或咨询技术老师。

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