人血管内皮生长因子A(VEGF-A)ELISA试剂盒实验使用说明书

　　BS-9809人血管内皮生长因子A(VEGF-A)ELISA试剂盒

　　一、产品概述

　　本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)，专用于检测人血清、血浆、组织匀浆、细胞培养上清等样本中的VEGF-A浓度。仅供科研使用。

　　二、试剂盒组成

　　预包被微孔板‌：12孔×8条(96孔规格)或12孔×4条(48孔规格)，预包被抗VEGF-A捕获抗体。

　　标准品‌：冻干粉，需用标准品稀释液复溶后倍比稀释(建议浓度梯度：10、3.33、1.11、0.37、0.12、0.04、0 ng/mL)。

　　检测抗体-HRP‌：辣根过氧化物酶标记的抗VEGF-A抗体。

　　洗涤缓冲液‌：20×浓缩液，需用蒸馏水按1:20稀释。

　　底物溶液‌：TMB显色液A/B，使用前1:1混合，15分钟内用完。

　　终止液‌：2M溶液。

　　样本稀释液‌：用于稀释高浓度样本。

　　封板膜‌：2张，用于温育时密封微孔板。

　　三、实验原理

　　VEGF-A与预包被捕获抗体结合，形成“抗体-抗原"复合物;加入HRP标记检测抗体后，形成“夹心结构"。经洗涤去除未结合物质，加入TMB底物显色(蓝色)，终止液终止反应后变黄色。450nm波长测定吸光度(OD值)，浓度与OD值呈正比。

　　四、实验步骤

　　样本准备‌

　　血清/血浆：离心去除颗粒物，避免溶血;2-8℃保存≤48小时，长期保存需-20℃/-80℃(避免反复冻融)。

　　细胞上清：离心取上清，避免含高浓度蛋白酶剂。

　　试剂准备‌

　　洗涤液：浓缩洗涤液室温结晶时，40℃水浴溶解后按1:20稀释。

　　标准品：复溶后倍比稀释，现配现用。

　　底物：TMB A/B液1:1混合，避光保存。

　　操作流程‌

　　加样‌：每孔加入100μL标准品/样本，37℃孵育90分钟。

　　洗涤‌：甩干孔内液体，用洗涤液浸泡1分钟/次，重复3次。

　　加检测抗体‌：每孔加入100μL HRP标记抗体，37℃孵育60分钟。

　　洗涤‌：同步骤2。

　　显色‌：每孔加入90μL TMB底物，37℃避光孵育15-20分钟。

　　终止‌：每孔加入100μL终止液，混匀后30分钟内测定OD值。

　　结果计算‌

　　以标准品浓度(ng/mL)为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线。

　　根据样本OD值代入曲线计算浓度，乘以稀释倍数得结果。

　　五、注意事项

　　试剂保存‌：未使用试剂盒需2-8℃避光保存，有效期6个月;复溶标准品可分装冻存，避免反复冻融。

　　样本处理‌：避免使用含的样本，防止HRP活性。

　　操作规范‌：移液需，避免气泡;洗涤需，防止交叉污染。

　　安全防护‌：终止液含强酸，需戴手套操作。

　　六、预期结果

　　灵敏度‌：≤1.54 pg/mL(实际以说明书为准)。

　　检测范围‌：典型范围为3.12-200 pg/mL，部分试剂盒扩展至62.5-2000 pg/mL。

　　重复性‌：板内/板间变异系数分别<10%和<15%。

　　七、常见问题解答

　　Q‌：显色过浅或过深?

　　A‌：调整样本稀释倍数或孵育时间;确保底物新鲜配制。

　　Q‌：标准曲线线性差?

　　A‌：检查复溶操作，避免气泡;更换移液器吸头。

　　注：以上仅供参考，本产品仅供科研使用，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。

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