人肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA检测试剂盒实验使用说明书

　　BS-0121人肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒

　　一、试剂盒简介

　　本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)技术，专用于定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的浓度。TNF-α是一种关键的细胞因子，在炎症反应、免疫调节及细胞凋亡中发挥重要作用。本试剂盒仅供科研使用，不可用于临床诊断。

　　二、试剂盒组成

　　预包被抗体酶标板‌：96孔板，包被有抗人TNF-α单克隆抗体，用于捕获样本中的TNF-α。

　　冻干标准品‌：2支，用于绘制标准曲线，浓度范围覆盖检测需求。

　　生物素标记检测抗体‌：与TNF-α特异性结合，形成免疫复合物。

　　辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(HRP-Streptavidin)‌：与生物素标记抗体结合，催化显色反应。

　　显色底物(TMB)‌：在HRP催化下产生蓝色产物，酸终止后变黄。

　　终止液(2M溶液)‌：终止显色反应，稳定颜色。

　　浓缩洗涤液(20倍)‌：用于洗涤酶标板，去除未结合物质。

　　样本稀释液‌：稀释样本至适宜浓度。

　　封板膜‌：防止蒸发和污染。

　　注：所有试剂需2-8℃避光保存，有效期6个月。

　　三、实验前准备

　　试剂平衡‌：所有试剂及样本使用前需室温(18-25℃)平衡30分钟，避免直接加热。

　　标准品配制‌：

　　每支冻干标准品加1mL标准品稀释液，室温静置10分钟，轻柔混匀。

　　配制梯度：从原液(如2000pg/mL)开始，进行系列稀释(如1000→500→250→125→62.5→31.2→0pg/mL)，共7个浓度点，空白孔为0pg/mL。

　　洗涤液配制‌：20mL浓缩洗涤液加580mL蒸馏水，混匀备用。

　　检测抗体工作液‌：临用前将生物素标记抗体用检测稀释液按1:100稀释(如10μL抗体+990μL稀释液)。

　　酶结合物工作液‌：HRP标记链霉亲和素按1:100稀释。

　　四、样本处理

　　血清/血浆‌：避免溶血，4℃保存不超过3天，-20℃长期保存避免反复冻融。检测前离心去除颗粒物。

　　细胞培养上清‌：离心去除细胞碎片，检测前确认细胞状态。若样本浓度过高，建议预实验确定稀释倍数。

　　五、操作步骤

　　加样‌：每孔加入100μL标准品或样本，37℃孵育90分钟。

　　洗涤‌：弃去孔内液体，每孔加400μL洗涤液，静置1-2分钟后甩干，重复3次。

　　加检测抗体‌：每孔加100μL生物素化抗体工作液，37℃孵育60分钟。

　　洗涤‌：同步骤2，重复3次。

　　加酶结合物‌：每孔加100μL酶结合物工作液，37℃孵育30分钟。

　　洗涤‌：同步骤2，重复5次。

　　显色‌：每孔加90μL TMB底物，37℃避光孵育15分钟。

　　终止反应‌：每孔加50μL终止液，立即测定OD值(450nm波长)。

　　六、注意事项

　　标准曲线异常处理‌：

　　平直曲线：检查标准品溶解是否充分、洗板是否净、移液是否准确。

　　高值样本：建议稀释后复测。

　　样本处理‌：

　　避免使用含NaN3的样本，因NaN3抑制HRP活性。

　　细胞上清需离心后检测，避免细胞碎片干扰。

　　关键控制点‌：

　　每步孵育时间误差不超过±5分钟。

　　洗板时拍板力度适中，避免交叉污染。

　　显色时间严格控制，避免过度反应。

　　七、结果计算

　　以标准品浓度(pg/mL)为横坐标，OD450值为纵坐标绘制标准曲线。

　　样本OD值代入标准曲线方程计算浓度，若超出检测范围(如31.2-2000pg/mL)需稀释后重测。

　　灵敏度：最小检测浓度小于15pg/mL，板内/板间变异系数<10%。

　　八、常见问题解答

　　问题现象 可能原因 解决方案

　　显色过快 酶结合物过量 减少孵育时间或稀释酶结合物

　　背景过高 洗涤不净 增加洗涤次数至5次

　　重复性差 移液误差 校准移液器，使用多道加样器

　　九、储存条件

　　未开封试剂盒：2-8℃避光保存。

　　已配制试剂：标准品溶液建议现配现用，其他工作液4℃保存不超过7天。

　　注：以上仅供参考，本产品仅供科研使用，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。

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