ELISA实验中标曲和样本的显色问题

　　以下是天津本生ELISA实验中关于 ‌标曲和样本显色问题‌ 的常见原因及解决方案，综合多篇文献分析整理：

　　一、标曲不显色或显色弱，样本正常

　　标准品溶解不充分‌

　　溶解时未涡旋震荡，导致标准品未溶解或稀释不均。

　　解决‌：使用涡旋震荡器充分混匀标准品及稀释液。

　　孵育条件不当‌

　　静置孵育导致抗原抗体接触不充分，建议使用微孔板振荡器(37℃)。

　　试剂漏加或失效‌

　　可能漏加检测抗体、酶标试剂，或试剂因反复冻融失活。

　　解决‌：分装保存试剂，操作时标记步骤避免遗漏。

　　二、标曲和样本均不显色

　　系统性问题‌

　　酶标试剂(如HRP)失活、底物(TMB)污染或过期。

　　解决‌：更换新鲜底物，检查试剂保存条件(避光、防潮)。

　　操作失误‌

　　未按说明书步骤操作(如漏加关键组分)。

　　解决‌：严格遵循操作流程，新手建议使用带染料的试剂盒辅助验证。

　　三、标曲显色正常，样本不显色

　　样本浓度过低‌

　　目标蛋白浓度低于检测限，或样本类型(如血浆、细胞上清)不匹配。

　　解决‌：尝试高敏ELISA试剂盒或浓缩样本。

　　样本干扰物质‌

　　溶血、细菌污染、类风湿因子等导致假阴性。

　　解决‌：离心去除杂质，添加蛋白酶抑制剂或稀释样本。

　　四、显色过强或无梯度

　　洗涤不净

　　残留HRP酶催化底物过度显色，尤其是TMB前最后一次洗涤。

　　解决‌：确保洗液注满孔，拍干液体，手动洗板时更换吸水纸。

　　底物孵育时间过长‌

　　TMB显色超过15分钟可能导致OD值饱和。

　　解决‌：显色10-15分钟后及时终止(最高浓度孔出现深蓝色即可)。

　　五、其他注意事项

　　移液精度‌：定期校准移液器，避免加样误差。

　　环境控制‌：避免底物(TMB)提前氧化(如避光保存)。

　　对照设置‌：阴阳性对照可帮助区分系统误差与样本问题。

　　通过规范操作和针对性排查，可显著改善显色异常问题。

　　注：以上资料仅供参考，不作为实验依据，具体请咨询技术老师或产品品牌供应商。

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