本生分享Elisa试剂盒实验的技巧及注意事项

　　以下是ELISA试剂盒实验的关键技巧与注意事项总结，本生结合操作规范与常见问题解决方案：

　　一、实验前准备‌

　　试剂平衡‌

　　所有试剂需提前30分钟室温平衡(20-25℃)，避免温度差异导致反应不均‌。

　　标准品溶解后需静置10-30分钟，避免涡旋震荡导致蛋白变性‌。

　　移液器校准‌

　　移液枪误差需<2%，每年至少校准一次，日常可用纯水自查‌。

　　加样时选择量程的35%-100%范围(如20μL用20-200μL枪)‌。

　　二、加样操作技巧‌

　　加样规范‌

　　枪头悬空45°贴壁加样，避免触碰孔底或产生气泡‌。

　　每孔加样量误差需<5%，复孔加样时间差≤5分钟‌。

　　顺序控制‌

　　加样顺序需一致(如标准品→样本→抗体)，显色时间需同步‌。

　　漏加样本需记录，不可补加(避免交叉污染)‌。

　　三、孵育与洗涤‌

　　孵育条件‌

　　37℃避光孵育(误差±0.5℃)，震荡孵育可提高反应效率‌。

　　封板膜需一次性使用，避免多次开闭导致污染‌。

　　洗涤要点‌

　　手工洗板需垂直拍干，机器洗板需检查冲洗头是否堵塞‌。

　　洗涤次数≥3次(含0.05% Tween-20)，每次30秒‌。

　　四、显色与终止‌

　　显色控制‌

　　TMB底物需全程避光，显色时间20分钟(最长不超过30分钟)‌。

　　显色过强时需提前终止(最高标准品显色达平台期)‌。

　　终止反应‌

　　终止液加入后5分钟内读数，避免信号衰减‌。

　　五、常见问题处理‌

　　问题‌ ‌解决方案‌

　　高背景值 增加封闭时间(1-2小时)或洗涤次数‌

　　标准曲线R²<0.98 检查标准品稀释是否充分混匀‌

　　显色不均 检查底物是否避光保存或酶标抗体失效‌

　　注：不同品牌试剂盒参数可能差异较大，建议以实际说明书为准。

　　注：仅供科研使用，以上资料供参考，如需具体产品说明请咨询技术老师或品牌供应商。

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