荧光定量PCR试剂盒在实验关键步骤及注意事项

　　以下是荧光定量PCR(qPCR)试剂盒实验的关键步骤及注意事项，天津本生结合操作规范与常见问题解决方案：

　　一、实验前准备‌

　　试剂与耗材‌

　　使用无RNase/DNase的枪头、EP管，避免RNA降解‌。

　　试剂盒组分需提前平衡至室温(20-25℃)，避免温度波动影响反应效率‌。

　　样本处理‌

　　RNA提取后需检测浓度(A260/A280=1.8-2.0)及完整性(RIN≥7)‌。

　　反转录cDNA时需设置无模板对照(NTC)和基因组DNA去除步骤‌。

　　二、反应体系配置‌

　　加样顺序‌

　　推荐先配制主反应混合液(含酶、dNTPs、缓冲液等)，再分装至各孔，最后加入模板‌。

　　加样误差需<5%，避免交叉污染(如使用排枪或自动化工作站)‌。

　　关键参数‌

　　引物终浓度通常为0.1-1μM，需通过梯度实验优化‌。

　　SYBR Green法需设置熔解曲线分析引物二聚体‌。

　　三、仪器操作‌

　　程序设置‌

　　三步法程序：95℃预变性10分钟→(95℃ 15秒→60℃ 30秒→72℃ 30秒)×40循环‌。

　　荧光信号采集需设置在退火/延伸阶段(SYBR Green法)或探针结合阶段(TaqMan法)‌。

　　数据采集‌

　　基线范围设为3-15循环，阈值设为指数期荧光信号10倍标准差‌。

　　四、常见问题与解决‌

　　问题‌ ‌可能原因‌ ‌解决方案‌

　　扩增曲线断裂 气泡干扰或模板浓度过高 瞬离去除气泡，稀释模板‌

　　无扩增信号 引物降解或反应条件不匹配 重新设计引物，优化退火温度‌

　　熔解曲线多峰 引物二聚体或非特异扩增 重新设计引物或提高退火温度‌

　　注：不同品牌试剂盒参数可能差异较大，建议以实际说明书为准‌。

　　注：仅供科研使用，以上资料供参考，如需具体产品说明请咨询技术老师或品牌供应商。

　　荧光定量PCR试剂盒 天津本生一直视质量控制为企业的生命，追求企业竞争力的不断提升。公司在经营中始终秉承：遵纪守法，严于律己，宽仁以待，敢于承担的企业精神作为标准，以过硬的质量和优良的服务来维护和拓展市场，较大限度的满足客户的需求。与客户的共赢，是我们的发展目标，本生，您信任的合作伙伴!本生试剂盒