加入酶标记检测抗体的核心注意事项

    使用酶标记检测抗体（常见的是酶标二抗）是ELISA、WesternBlot、免疫组化等实验中的关键步骤。以下是需要重点关注的方面，分为实验前、实验中、实验后三个阶段。

    一、实验前准备：抗体选择与保存

    特异性是关键

    宿主来源：确保检测抗体（二抗）所针对的宿主物种与一抗的宿主物种匹配。例如，小鼠来源的一抗应选择抗小鼠的酶标二抗。

    免疫球蛋白类型：确认一抗的亚型（如IgG,IgM），并选择针对该亚型的二抗，以获得信号。

    交叉吸附：在进行多重检测或样本含有多种物种蛋白时，应选择经过交叉吸附的二抗，以减少非特异性结合。

    酶与底物系统的选择

    HRP（辣根过氧化物酶）：

    优点：成本低、灵敏度高、底物多样（如TMB,DAB）。

    注意事项：严禁使用含叠氮钠（NaN₃）的缓冲液，因为NaN₃是HRP的抑制剂。同时，要避免溶液被微生物污染。某些还原剂（如DTT）也会使其失活。

    AP（碱性磷酸酶）：

    优点：稳定性好，不受NaN₃影响。

    注意事项：应避免使用含有磷酸根离子的缓冲液（如PBS），因为磷酸根是AP的竞争性抑制剂。推荐使用Tris缓冲液。

    抗体的保存与稀释

    正确保存：严格按照说明书要求保存，通常是-20℃分装冻存，避免反复冻融。

    使用前离心：短暂离心小管，将液体收集至管底，避免损失和起泡。

    优化稀释比例：必须进行预实验来优化二抗的稀释比例。说明书提供的范围是一个参考起点。浓度过高会导致背景深，浓度过低则信号弱。

    二、实验过程中：孵育与洗涤

    封闭要充分

    在加入检测抗体前，必须用惰性蛋白（如BSA、脱脂奶粉、血清等）对膜或板进行充分封闭，以封堵非特异性结合位点，这是降低背景的关键。

    孵育条件优化

    温度与时间：室温孵育1小时或4℃过夜。4℃过夜通常结合更牢固，背景更低，但需要更长时间。室温孵育更快捷，但需注意控制时间和温度，避免背景过高。

    避光：如果酶标抗体偶联了荧光染料，整个孵育过程需避光。

    均匀孵育：确保抗体溶液能均匀覆盖整个样本，放在摇床缓慢摇动孵育效果更佳。

    洗涤至关重要

    洗涤：孵育后，必须使用洗涤缓冲液（如TBST、PBST）进行充分且严格的洗涤，以去除未结合的游离抗体。这是降低背景有效的一步。

    洗涤次数与体积：通常建议洗涤3-5次，每次浸泡并摇动3-5分钟。使用足量的洗涤液。

    三、实验后：显色与结果分析

    底物使用与显色

    新鲜配制：尤其是HRP的底物，建议在使用前新鲜配制，以保证其活性。

    避光反应：某些底物（如ECL）对光敏感，显色反应需在暗室进行。

    控制反应时间：显色反应时间不宜过长，否则会导致背景过高。一旦达到理想的信号强度，应及时终止反应（对于ELISA）或进行成像（对于WB）。

    设立对照

    阴性对照：不加一抗（只加封闭液和二抗），用于评估二抗的非特异性结合背景。

    空白对照：不加一抗和二抗，用于评估底物自身的显色情况。

    阳性对照：使用已知阳性的样本，确保整个实验系统工作正常。

    总结

    成功使用酶标记检测抗体是一个系统性的优化过程，核心在于：

    选对（特异性）

    用好（稀释度、孵育条件）

    洗净（降低背景）

    控好（底物反应与对照）

    遵循以上注意事项，将能显著提高实验的可靠性、灵敏度和重复性。

    注：以上仅供参考，不作为实际数据，实验需严格遵循说明或咨询技术老师。

    ELISA试剂盒实验本生一直视质量控制为企业的生命，追求企业竞争力的不断提升。公司在经营中始终秉承：遵纪守法，严于律己，宽仁以待，敢于承担的企业精神作为标准，以过硬的质量和优良的服务来维护和拓展市场，较大限度的满足客户的需求。与客户的共赢，是我们的发展目标。本生!您信任的合作伙伴。我们愿与您真诚合作，共创美好的未来。