ELISA双抗体夹心法关键步骤详解

　　以下是本生技术小编对ELISA双抗体夹心法的关键步骤详解，结合操作要点和注意事项进行结构化说明：

　　一、实验原理概述‌

　　双抗体夹心法通过‌两种特异性抗体‌(包被抗体和酶标抗体)结合抗原的不同表位，形成“夹心"结构，最终通过酶催化底物显色实现定量分析‌。适用于检测二价或以上大分子抗原‌。

　　二、关键操作步骤‌

　　1. ‌包被抗体‌

　　固相载体准备‌：选择聚苯乙烯酶标板(需验证蛋白结合能力)，pH 9.0-9.6缓冲液稀释抗体至浓度(需预实验滴定)‌。

　　包被条件‌：4℃过夜孵育或37℃ 2小时，确保抗体充分结合‌。

　　2. ‌封闭未结合位点‌

　　使用1-5% BSA或脱脂牛奶封闭，37℃孵育1小时，减少非特异性吸附‌。

　　3. ‌加样与孵育‌

　　标准品/样本‌：每孔加入100μL，37℃孵育1小时，确保抗原与包被抗体结合‌。

　　洗涤‌：PBS洗涤4-6次，每次30秒，拍干后保持孔内湿润‌。

　　4. ‌酶标抗体反应‌

　　加入生物素化抗体(与包被抗体结合不同抗原表位)，37℃孵育1小时‌。

　　再次洗涤后，加入HRP-链霉亲和素(若使用信号放大系统)‌。

　　5. ‌显色与终止‌

　　加入TMB底物，避光孵育15-30分钟，观察梯度显色‌。

　　加入2Mliusuan终止反应，蓝色立转黄色‌。

　　三、注意事项‌

　　抗体配对‌：包被抗体与酶标抗体需识别抗原不同表位，避免交叉反应‌。

　　样本处理‌：避免溶血或纤维蛋白干扰，离心去除颗粒物‌。

　　洗涤控制‌：推荐自动化洗板机(350μL/孔，震板5秒)，减少背景噪声‌。

　　通过规范操作可显著提高实验重复性，避免钩状效应(高浓度抗原导致假阴性)‌。

　　注：以上资料仅供参考，如需进一步了解产品详情，可参考品牌供应商或技术老师。

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