ELISA实验：标准品稀释步骤指南

　　本生(BUNSEN)为您详细讲解ELISA实验中稀释标准品的关键步骤和注意事项。这是实验成功与否的基石，精确的稀释决定了标准曲线的质量，从而直接影响最终结果的准确性。

　　一、核心原则

　　标准品稀释的目的是创建一系列已知浓度的标准点，用以绘制标准曲线(通常为S型或线性化后的直线)。未知样本的浓度将通过此曲线计算得出。因此，稀释的精确性和一致性至关重要。

　　二、实验前准备

　　试剂与材料：

　　标准品冻干粉:从冰箱中取出，室温静置15-20分钟平衡至室温。

　　标准品/样本稀释液:务必使用试剂盒指定的专用稀释液。不同的检测目标(细胞因子、激素等)可能需要不同的基质(如血清、血浆模拟液)，以避免干扰。

　　去离子水或超纯水：用于复溶冻干粉。

　　无菌离心管(1.5mL EP管)、试管或细胞培养板(用于系列稀释)。

　　精确的可调移液器(如P1000, P200, P20)及匹配的、洁净的低吸附吸头。

　　涡旋混合器 和 小型离心机。

　　说明书：

　　仔细阅读试剂盒说明书，确认标准品的初始浓度(如 1000 pg/mL)和需要复溶的体积(如 500 μL)。

　　确认说明书建议的标准曲线浓度范围(如 7.8 pg/mL - 500 pg/mL)和稀释倍数。常见的梯度是倍比稀释(Serial Dilution)。

　　三、操作步骤

　　第一步：复溶

　　离心：将标准品冻干粉管短暂离心(如 3000 rpm, 1分钟)，使粉末集中到管底，避免开盖时损失。

　　加液：加入说明书指定体积的去离子水或指定的复溶液。

　　混匀：轻轻涡旋(避免产生过多气泡)或上下吹打至少1分钟，确保粉末溶解。切勿剧烈振荡。

　　静置：室温静置10分钟，使其充分水化。此时溶液的浓度即为最高浓度储备液(Stock Solution)。

　　第二步：配制最高浓度点

　　取一个洁净试管，加入一定体积的稀释液(例如 900 μL)。

　　吸取一定体积的复溶后的标准品储备液(例如 100 μL)加入稀释液中。

　　轻轻涡旋或吹打混匀。此管浓度即为标准曲线的最高浓度点(例如，1000 pg/mL储备液稀释10倍，得到 100 pg/mL的最高点)。

　　示例：若储备液为1000 pg/mL，要配制500 pg/mL的最高点，可采取1:1稀释(如500μL储备液 + 500μL稀释液)。

　　第三步：系列倍比稀释

　　这是最关键的一步。以制备7个浓度点为例(从最高浓度点开始稀释)：

　　取7-8个排在一起的试管或孔板，除第一管外，每管加入等体积的稀释液(例如 300 μL)。

　　第1管：加入与稀释液等体积的“最高浓度点"溶液(例如 300 μL)，此时第1管浓度即为最高浓度(如 100 pg/mL)。

　　第2管：从第1管中吸取等体积液体(例如 300 μL)，移至第2管中。轻轻吹打或涡旋混匀。

　　后续管：重复此过程：从第2管取 300 μL 加入第3管，混匀;从第3管取 300 μL 加入第4管，混匀……直至稀释到最后一管。

　　最后一管：从最后一管(浓度点)中吸取 300 μL 液体并弃去，以保证所有管的体积一致。

　　四、关键注意事项(本生提醒您)

　　低温操作：对于非常不稳定的蛋白，整个稀释过程请在冰上进行，并使用预冷的稀释液和器具。

　　避免吸附：使用低吸附的移液器吸头和试管，以减少蛋白在管壁上的损失，这对于低浓度点尤其重要。

　　充分混匀：每一次转移后都必须充分混匀，这是保证梯度准确性的关键。但需避免产生气泡。

　　更换吸头!每一步稀释都必须使用新的无菌吸头，否则会污染后续所有浓度，导致实验失败。

　　及时使用：稀释好的标准品应尽快加入酶标板孔中，通常建议在30分钟内使用。

　　设置复孔：加样时，每个浓度点建议做2-3个复孔，以提高数据的可靠性。

　　通过遵循以上步骤，您将能制备出一条准确、可靠的标准曲线，为整个ELISA实验的成功奠定坚实基础。

　　注：仅供科研使用，以上资料供参考，如需具体产品说明请咨询技术老师或品牌供应商。

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